質(zhì)粒DNA的提取與純化
質(zhì)粒是一類(lèi)雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1 kb至200 kb以上不等。通常情況下，質(zhì)?？沙掷m(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，具有自主復(fù)制功能;但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到宿主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。關(guān)系到下游實(shí)驗(yàn)操作的成敗。提取質(zhì)粒DNA的方法很多，目前應(yīng)用的是堿裂解-中和法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋
質(zhì)粒已成為核酸克隆和測(cè)序zui常用的載體。質(zhì)粒DNA提取的產(chǎn)量和純度直接白質(zhì)與DNA發(fā)生變性;當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)保留在上清液中;蛋白質(zhì)與染色體DNA不能復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。
質(zhì)粒DNA的純化方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小以及共價(jià)閉環(huán)這兩個(gè)性質(zhì)，例如氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法。但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡(jiǎn)單步驟即可去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA可滿足酶切、轉(zhuǎn)化、探針標(biāo)記、測(cè)序等要求。然而該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，需要接觸苯酚、氯仿等有毒溶劑，而且所提取的質(zhì)粒 DNA有時(shí)不能被限制性?xún)?nèi)切酶*消化，因此在追求效率的今天，這種方法已逐漸被質(zhì)量可靠、快捷便利的離心吸附柱純化方法所代替。
線性DNA片段的純化
PCR產(chǎn)物或酶促反應(yīng)的DNA片段中所含的酶、鹽類(lèi)、殘留引物、dNTP和其他DNA片段有可能影響后續(xù)反應(yīng)的效果，故需經(jīng)過(guò)純化處理。 對(duì)于電泳檢測(cè)觀察到的單一條帶，可以采用乙醇沉淀回收或單純過(guò)柱回收方法;對(duì)于有非特異性條帶或其他雜帶的DNA片段，則有必要進(jìn)行膠回收純化。目前商品化的DNA片段回收試劑盒多采用硅膠基質(zhì)材料特異性地吸附DNA，通過(guò)高鹽/乙醇洗脫，清除雜質(zhì)。由于各種試劑盒所采用的硅膠基質(zhì)材料不同，DNA片段的回收效率也存在著很大的差異。
基因組DNA的提取、純化
基因組DNA相對(duì)穩(wěn)定，故其提取方法也相對(duì)簡(jiǎn)單。通常細(xì)胞通過(guò)表面活性劑處理，釋放出基因組DNA，經(jīng)過(guò)蛋白酶和RNA酶消化后，經(jīng)有機(jī)溶劑抽提和乙醇沉淀或過(guò)柱純化即可獲得一定量的基因組DNA。目前商品化的基因組DNA提取試劑盒分為溶液型和離心吸附柱型兩種。溶液型產(chǎn)品價(jià)格經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)率高，可獲取適用于建立文庫(kù)的高分子量DNA，并且可盡可能地回收稀有樣品中的DNA;但操作過(guò)程較為繁瑣，對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能要求較高。離心吸附柱型產(chǎn)品使用方便、快速，提取的DNA 純度較高，但價(jià)格昂貴，產(chǎn)量偏低，并且得到的片段多在20 kb左右，不適合建立DNA文庫(kù)或用作長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物的模板.