服務(wù)熱線
021-66030766
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription,RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù),近年來(lái)得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。首先,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用,以RNA為模板,合成互補(bǔ)的DNA鏈(cDNA),再以cDNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛。獲得的cDNA可用于基因的擴(kuò)增、克隆,基因表達(dá)水平的檢測(cè),細(xì)胞內(nèi)RNA病毒的含量等。
A.反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase,RTase)
自然界中廣泛存在著一類以RNA為遺傳物質(zhì)的反轉(zhuǎn)錄病毒,其攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板,合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛的有鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus,AMV)反轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L:Leukemin Virus,M-MLV) 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)及其改造重組體M-MLV(RNase H-)。AMV RT具有反轉(zhuǎn)錄活性高、zui適反應(yīng)溫度較高(41~50℃)的特點(diǎn),可以較好地克服由于模板二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的逆轉(zhuǎn)錄困難問(wèn)題,然而由于AMV RT的RNase H活性高,易降解cDNA-RNA復(fù)合物中的RNA鏈,導(dǎo)致合成的cDNA片段偏短,一般為1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性較低,合成的cDNA可達(dá)3~4 kb,比較適宜全長(zhǎng)cDNA的合成。但M-MLV RT擴(kuò)增效率較低,zui適反應(yīng)溫度在37℃左右,故對(duì)于具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板逆轉(zhuǎn)錄效果不佳。經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變的M-MLV RT(RNase H-),基本上消除了RNase H酶活性,并將酶的zui適反應(yīng)溫度提高到42℃,大大提高了cDNA鏈的延伸性和產(chǎn)率,更適于完整基因的獲得。我公司提供的StarScript Reverse Transcriptase(Cat. No. A211)即為經(jīng)過(guò)多重定點(diǎn)突變、具有高擴(kuò)增能力的RNase H酶活性缺失型M-MLV RT,非常適合用于較長(zhǎng)的cDNA合成以及高比例的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建等。
B.模板RNA
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中作為模板的RNA樣品可以是提取的總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。提取RNA的方法多種多樣,如單相試劑法(TRIGene,Cat. No. P118;TRIGene LS,Cat. No. P119)、過(guò)柱純化法、磁珠法等。無(wú)論使用哪種方法,zui關(guān)鍵因素是抑制RNA酶活性并zui大限度地去除基因組DNA污染。
C.引物
用于反轉(zhuǎn)錄的引物應(yīng)視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇。常用的引物有Oligo(dT)12-18、隨機(jī)引物(Random Hexamer)和基因特異性引物(Gene-specific primer,GSP)。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,三種引物都可采用。Oligo (dT)12-18只適用于具有PolyA尾巴的RNA,對(duì)無(wú)PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。因Oligo (dT)12-18引物需與mRNA的PolyA尾結(jié)合,所以對(duì)RNA模板的質(zhì)量要求很高,即使模板有少量降解也會(huì)影響全長(zhǎng)cDNA的合成量。隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板,但由于特異性低,主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的互補(bǔ)引物,特異性好,但僅適用于目的序列已知的情況。
D.其它影響因素
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受多個(gè)因素的影響,如Mg2+濃度、引物退火溫度、擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。對(duì)于具有較高Tm值的引物,增加退火和延伸時(shí)的溫度對(duì)反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合,因而提高特異產(chǎn)物的得率。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的優(yōu)化參見(jiàn)“1.7 RT-PCR常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案“部分。
E.一步法和兩步法RT-PCR
RT-PCR可以通過(guò)一步法或兩步法的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)。一步法即將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成,減少加樣步驟,有助于減少污染。由于所有的cDNA產(chǎn)物都用于PCR擴(kuò)增,其靈敏度非常高,尤其適用于檢測(cè)大量樣品和實(shí)時(shí)定量PCR。兩步法將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分開進(jìn)行,在選擇DNA聚合酶(如高保真度、高特異性、長(zhǎng)片段等)和引物時(shí)具有更大的靈活性。
聯(lián)系方式
郵件:sh-jiapeng@163.com